Real-time PCR. Diagnostiek van de toekomst

De afgelopen decennia is er veel veranderd binnen de tandheelkundige diagnostiek. Was men vroeger nog uitsluitend aangewezen op traditionele microbiologische kweektechnieken, nu kan men gebruik maken van een scala aan moderne technieken.
Aan de grondslag van de moleculaire technieken ligt de polymerase kettingreactie, oftewel de PCR (Polymerase Chain Reaction). Deze PCR-techniek maakt het mogelijk om zoveel identieke kopieën van een DNA streng te maken, als gewenst is. Zodoende kan men aan voldoende materiaal komen om diagnostiek op uit te voeren.

Briljant in zijn eenvoud
De PCR is al in het begin van de 80-er jaren van de vorige eeuw ontwikkeld door Kary Mullis. De techniek achter de PCR is briljant in al zijn eenvoud en bestaat uit drie fasen. In de eerste fase wordt het dubbelstrengs DNA gesplitst door het te verhitten. In fase 2 wordt de temperatuur verlaagd waardoor er kleine stukjes DNA (de primer) kunnen koppelen. Deze primer is zo gekozen dat alleen het gewenste DNA vermeerderd wordt. In fase 3 wordt de temperatuur weer verhoogd, waardoor het enzym DNA-polymerase de DNA keten kan verlengen.

Deze drie stappen samen worden een cyclus genoemd. Afhankelijk van de hoeveelheid materiaal dat nodig is, wordt een aantal cycli herhaald. Uiteindelijk heeft men dus een bepaalde hoeveelheid identieke DNA strengen. Helaas is het niet zo dat het DNA bij elke cyclus verdubbelt. Dit is alleen het geval in de exponentiële fase als bijvoorbeeld van alle reagentia nog voldoende voorhanden is. Na verloop van tijd kunnen reagentia op raken. Hierdoor zal de reactie vertragen en vindt er geen verdubbeling meer plaats. Deze fase wordt ook wel lineaire fase genoemd. Na verloop van tijd zal de reactie zelfs stoppen en is de plateaufase bereikt.

In deze fase vindt, traditioneel, de meting plaats. Omdat nooit met zekerheid te zeggen is hoeveel uitgangsmateriaal er aanwezig is geweest, is de traditionele PCR techniek niet geschikt om exacte aantallen te bepalen. Dit nadeel kan men omzeilen, door bij elke cyclus de hoeveelheid DNA te meten. Deze techniek noemt men real-time PCR of kwantitatieve (quantitative) PCR. Deze vorm van PCR is kwantitatief omdat de hoeveelheid DNA in een sample precies kan worden bijgehouden.

Exacte hoeveelheid DNA
Op dit moment zijn er verschillende technieken om het DNA te meten, waarvan de SYBR green en de TAQ-MAN methode de meest gebruikte zijn. Beide technieken geven meer fluorescerend licht naarmate er meer DNA gevormd wordt. Als er ook een bekende hoeveelheid DNA van een standaard meegenomen wordt, kan de exacte hoeveelheid DNA in het uitgangsmateriaal bepaald worden. Op dit moment is de real-time PCR de meest nauwkeurige methode om DNA te meten. De voordelen van real-time PCR zijn legio: snelle, nauwkeurige en kwantitatieve resultaten, waarbij het niet belangrijk is of het uitgangsmateriaal levend of dood is. Ook dode cellen hebben tenslotte DNA.

Een ander groot voordeel is dat, theoretisch gezien, alles wat DNA bevat, bepaald kan worden. Zo kunnen niet kweekbare bacteriën als de Treponema denticola geanalyseerd worden, maar ook schimmels, gisten en virussen. Het belangrijkste nadeel van de real-time PCR is dat je met een gesloten vraagstelling werkt, echter zal dit binnen de meeste vakgebieden van de tandheelkunde geen problemen opleveren, omdat vaak al vaststaat welke micro-organismen de problemen veroorzaken.

Heden
De afgelopen jaren heeft de real-time PCR een grote vlucht genomen in de medische wetenschap. Waren er in 1995 slechts 42 artikelen met real-time PCR als onderwerp, vorig jaar was dat al gestegen tot bijna 23.000. En het einde is nog lang niet in zicht. Wekelijks verschijnen er nieuwe artikelen waarin real-time PCR toepassingen beschreven worden, variërend van voedselveiligheid tot tumoronderzoek. Ook binnen de tandheelkunde stijgt de populariteit van de real-time PCR. Op dit moment kunnen er al een groot aantal paropathogenen gekwantificeerd worden via de real-time PCR techniek, maar bijvoorbeeld ook Candida albicans en het herpesvirus.

Toekomst
In theorie kan de real-time PCR methode gebruikt worden voor de diagnostiek van alle DNA bevattende (micro)organismen. In vele tandheelkundige branches spelen micro-organismen een belangrijke rol. Hierbij kan men denken aan endodontie, implantologie en parodontologie. Het lijkt een kwestie van tijd voor de real-time PCR een vaste plaats heeft verworven binnen de dentale diagnostiek.

In de praktijk
U heeft een patiënt in de stoel met verdiepte pockets. U bent onder andere benieuwd hoeveel bacteriën er in de pocket van uw patiënt aanwezig zijn en daarom neemt u met behulp van een paperpoint een monster. Dit stuurt u dezelfde dag nog op naar een gespecialiseerd laboratorium. Aangekomen in het laboratorium vinden de volgende handelingen plaats:

• Het DNA wordt door middel van een extractiemethode uit het monster gehaald. Hiertoe worden de bacteriën kapot gemaakt, waardoor de celinhoud met daarin het DNA vrijkomt.
• Een kleine hoeveelheid van het extract wordt samen met een bekende hoeveelheid DNA in het real-time PCR apparaat geplaatst. Ook worden er positieve en negatieve controles meegenomen om te controleren of de PCR reactie succesvol verloopt.
• Per cyclus wordt bijgehouden hoeveel DNA er gevormd is.
• De hoeveelheid in het extract wordt vergeleken met de bekende hoeveelheid.
• Nu kan het aantal bacteriën in het uitgangsmateriaal uitgerekend worden.
• U ziet dat er veel bacteriën in de pocket van uw patiënt aanwezig zijn en u besluit de pocket grondig te gaan schoonmaken.

Uitgelicht: De bepaling van het totaal aantal bacteriën door middel van de real-time PCR techniek.
Eén van de eerste toepassingen van de real-time PCR techniek binnen de tandheelkunde was de bepaling van het totaal aantal bacteriën. Dit kan bijvoorbeeld gaan over het totaal aantal bacteriën in een ontstoken pocket, maar ook over het totaal aantal bacteriën in het speeksel van uw cariës risico patiënt.

Uit onderzoek is gebleken dat alle bacteriën op aarde een conservatief stukje DNA hebben. Van de Thermophilus aquaticus in de geiser van Yellowstone tot aan de Chryseobacterium greenlandensis in een gletsjer op Groenland. Verschillende bedrijven en universiteiten hebben een primer, een stukje synthetisch DNA, ontwikkeld dat uitsluitend bindt aan dit conservatief stukje DNA. Dit is mogelijk door de unieke eigenschappen van het DNA dat opgebouwd is uit verschillende basenparen. A koppelt alleen met T en C koppelt alleen met G. De volgorde van de basenparen van de primer kan zo gekozen worden dat er een unieke binding met het conservatieve stukje DNA bewerkstelligd kan worden. Door een standaard met een bekende hoeveelheid DNA mee te laten lopen, kan ook in het monster de hoeveelheid DNA en daarmee ook de hoeveelheid bacteriën bepaald worden.

Bron: Bio2Dental